【化学发光】常用化学发光免疫分析技术及其特点技术介绍!

化学发光免疫分析是将发光免疫分析和免疫反应相结合，而建立的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术，一种非放射性标记免疫分析技术。因其具有简便易行、稳定性高、便于实现全自动化和不污染环境等优点，尤其是能在较短的时间内得到实验结果。深受检验医学工作者和l临床医师的好评。在国外广泛应用于临床常规检验和科学研究；近年来，化学发光分析技术发展很快，特别是化学发光免疫分析技术，国外已开发出多种化学发光物质、CLIA系统。以及全自动化学发光仪。不同的化学发光物质发光机理和发光性能不同，不同的CLIA系统原理和方法各异。现介绍如下：

1，化学发光免疫分析的原理

发光物标记的CLIA是以发光物质代替放射性核素或酶作为标记物如吖啶酯，在反应体系中发光物质在碱性介质中氧化时释放大量自由能，产生激发态的中间体，该激发态的中间体由最低振动能级回到稳定的基态，各个振动能级时产生辐射，同时产生能量，多余的能量即为发射光子，从而产生发光现象。利用发光信号的测量仪器，分析接收光量子的产量，通过计算机系统转换成被测物质的浓度单位。

2，化学发光免疫分析中的标记物质及类型

2.1直接参与发光反应的标记物质：这类标记物在化学结构上有产生发光的特殊基团，在发光免疫分析过程中直接参与发光反应。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物，是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂的作用而发光，强烈的直接发光在lS内完成，为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无需催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。

2.2以酶催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记物：这类标记物作为发光反应的催化剂或作为一种能量传递过程中的受体，其本身又直接参与发光反应。从标记免疫分析角度，酶催化化学发光免疫分析应属酶免疫分析．只是酶反应的底物是发光剂。操作步骤与酶免疫分析完全相同，以酶标记生物活性物质(in酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶fHRP)~1碱性磷酸酶(ALP)，它们有各自的发光底物。

2.2.1辣根过氧化物酶：常用的底物为鲁米诺或其衍生物如异鲁米诺，鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧f过氧化阴离子、单线态氧、羟自由基、过氧化氢)存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。钮心怡等采用特异性的两株C—P单克隆抗体，辣根过氧化物鲁米诺酶促增敏化学发光体系，利用双抗体夹心法检测，敏感度为0．102ug／L；检测线性范围为0．102～20ug／L；多人次检测证实试剂盒批内变异均小于l0％，分析间变异小于15％；与18u/L人胰岛素原、2000mIU／L的人胰岛素无显著交叉反应。

2.2.2碱性磷酸酶：所用底物为环1，2一二氧乙烷衍生物，用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团——金刚烷基，其分子中发光基团为芳香基团和酶作用的基团，在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。冯艳铭等采用双抗体异位点一步夹心法，以甲胎蛋白单克隆抗体作为固相包被。采用改良过碘酸钠法进行甲胎蛋白多克隆抗体与碱性磷酸酶偶联制备酶标抗体：以金刚烷胺衍生物CSPD作为底物，优化CSPD与SapphireII发光体系用国家标准品校定定量标准品。建立了人血清AFP的化学发光免疫定量分析法。利用化学发光酶免疫分析方法．以碱性磷酸酶作为标记物，环l，2二氧乙烷衍生物AMPPD为发光底物，测定血清中的糖抗原50，检出限为1.0umo~L，线性范围为0～300umol／L。批内精密度<7％，批间精密度为11％。

2.3以能量传递参与氧化反应的非酶标记物：这类标记作为化学反应的催化剂或能量传递过程中的中间体(或受体)，不直接参与化学反应。在这类反应中参与能量传递反应的标记物含量与免疫反应中抗原抗体复合物形成的量呈正相关，并直接与反应底物产生的光子强度相关，该体系中的发光物质在激发态与基态的活动越强，产生的光子就越多，其发射光的强度与被检测物的浓度呈正相关。最常用的有三联吡啶钌标记物，该系统由三丙胺(TPA)和三联吡啶钉N基羟基琥珀酰胺酯(NHS)组成。吡啶钌标记抗体，TPA参与氧化还原反应。其发生氧化还原反应产生光子的过程需在电极表面进行。因而，该系统号门用于电化学发光免疫分析。电化学发光免疫分析的反应在电极表面进行，发光底物为j三联吡啶钌，用另一反应物三丙胺来激发光反应。在阳极表面，这两种物质可同时失去电子，发生氧化反应。在电极板上二价的三联吡啶钉迅速被氧化成三价三联吡啶钌．与此同时三丙胺也在电极板上被氧化成三丙胺阳离子自由基，三丙胺阳离子自由基自发地释放一个质子而变成三丙胺非稳定分子，将一个电子递给三价三联吡啶钌，形成激发态的二价三联吡啶钌。激发态的二价三联吡啶钌在衰减的同时发射一个波长为620nm的光子，重新回到基态二价三联吡啶钌。这一过程在电极表面反复进行。产生高效、稳定的连续发光，并不断增强。张继东用电化学发光免疫分析法在检测乙肝标志物，发现用电化学方法检测，灵敏度更高，专属性更强。

3，临床免疫检测中常见的化学发光免疫类型及特点

3．1化学发光酶免疫分析(CLEIA)是采用以催化反应参与发光的酶如过氧化物酶作为标记物，标记检测用的抗体或抗原，待测样本与检测试剂进行免疫反应后，形成的酶标记抗原一抗体复合物上的酶对鲁米诺过氧化氢体发光底物体系发生催化作用，产生发光效应，测定发光强度信号可分析被测抗原或抗体的含量。酶促发光的共同特点为发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂充分．因此发光信号强而稳定，且发光时间较长。因此可采用速率法测量，故检测方式简单、成本较低。酶促反应的主要缺点是工作曲线可能随时问漂移，而且低端斜率容易呈非线性下移。传统的化学发光反应多在几秒内以闪光的形式发射，因此须在反应物瞬间形成发光物时立即测定，且常因混合不均匀及测定不及时而影响结果的重复性。在这类分析中。化学发光强度取决于抗原一抗体结合的量，抗原一抗体复合物越多，参与催化反应的酶越多，发光信号越强。

3.2微粒子化学发光免疫分析(ECIA)：它是以顺磁性微珠作为载体包被抗体。利用磁性微珠能被磁场吸引，在磁力的作用下发生力学移动的特性。迅速捕捉到被测抗原，当加人标本后，标本中的抗原与磁珠抗体形成复合物磁力作用下，协助复合物快速地与其他非特异性物质分离，使抗原抗体结合反应的时间缩短，测定时间减少，降低了交叉污染的几率，此时再加入ALP标记的第二抗体。形成磁珠包被抗体一抗原一酶标记抗体复合物，经洗涤去掉未结合的抗体后，加入ALP的发光底物AMPPD，AMPPD被复

合物上ALP催化，迅速去磷酸基团，生成不稳定的中间体AM—PD，AMPD的快速分解，从高能激发态回到低能量的稳定态时，持续稳定地发射出光子(hv)，发射光所释放的光量子被系统记录，通过计算机处理系统将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗原浓度。其既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析的高度特异性，检测快速．试剂无放射危害。微粒子化学发光免疫分析的优点在于安全(无放射危害1、稳定、测量快速、灵敏度高、线性范围宽、自动化程度高、减少了人为的误差。检测快速缩短了等待结果的时间，无需批量检测可随到随测保证及时提供结果。缺点在于一般化学发光是标记催化酶或化学发光分子的发光反应，一般发光不稳定，为间断的、闪烁性发光，而且在反应过程中易发生裂变，导致反应结果不稳定。此外，检测时需对结合相、游离相进行分离，操作步骤

多，测试成本高。主要问题是化学发光的产生通常是瞬间完成的，发光的峰值很快衰减，再是本底较高和干扰妨碍应用。

3.3电化学发光免疫分析(ECLIA)：ECLIA是化学发光免疫分析中的新一代标记免疫分析技术，与其他的标记发光分析的原理不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，包括了电化学和化学发光两个部分。早在60年代人们就开始研究电化学发光．文献上报导了许多物质的电化学发光．如多环芳烃类、酰肼类和联吡啶类化合物等。但最常用于ECLIA的化学物质是三联吡啶钌[Ru(bpy)3]其工作原理是结合了标记物的生物分子与配体发生特异的结合反应后进人流动测量室．电发光过程被启动。其化学发光主要是基于Ru(bpy)3络合物和三丙胺rrPA+1两种电化学活性底物在反应中引起的光子发射，含三丙胺(TPA1的缓冲液进入测量室，同时电极加电，化学发光剂Ru(bpy)3和电子供体TPA在阳电极表面同时各失去一个电子发生氧化反应，二价的[Ru(bpy)3]被氧化成三价，TPA被氧化成阳离子自由基TPA+，并迅速自发地脱去一个质子fH+1，形成自

由基TPA+。由于Ru(bpy)是强氧化剂，自由基1是强还原剂，两个高反应基团在电极表面迅速反应，Ru(bpy)“被还原形成激发态的二价[Ru(bpy)3，TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。接着激发态~[Ru(bpy)衰减成基态的[Ru(bpy)3]，同时发射一个波长620nm的光子。这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与[au(bpy)“的浓度呈线性关系，可测出待配体的含量。电化学发光的主要特点是发光过程中的标记物基本不被消耗，而反应体系中其他成分充分过量，因此发光信号强而稳定，且发光时间较长。其缺点为测量方式复杂、仪器成本及维护费用高；同时环境及样品中同类元素也存在较弱的本底干扰：反复使用的流动池可能导致交叉污染；而冲洗或进样中产生的气泡也会干扰测定；同时繁琐冗长的冲洗过程也会成为提高检测效率的瓶颈。另外，使用磁性或非磁性微粒时，强烈的散射吸收作用也会降低灵敏度。

4，化学发光免疫分析技术的新进展

4.1新的标记物：近年来，科学家们致力于化学发光物质的研究．通过往发光体系中加入增加化学增强剂来增加量子产率以及发光时间，同时一些学者将目光集中于新的标记发光物的开发中。并取得了相应成果。目前已证明从棕榈树和大豆中提取的HRP的阴离子型同工酶(HRP2A)在没有增强剂的情况下可以高效、常时间催化luminol—H202体系发光，并且HRP—A比HRP—C稳定性更好，这在酶标记物的储存中是非常重要的。而白细胞碱性磷与ALP一样，也有催化性能，并已用于化学发光的检测。此外，还通过合成技术合成了吖啶酯类化学发光试剂。

4.2新标记技术的应用：固相标记方法的应用，减少游离标记物以及聚合蛋白质：纳米技术与生物分析的结合，即利用Au、Ag等阳离子对化学发光具有催化放大作用，提高检测灵敏度。利用电化学发光免疫分析方法，将N一氨丁基．N．异鲁米诺fABED作为发光标记试剂标记在金毫微粒改性的石蜡活化的石墨电极上，测定人体IgG。电化学发光的强度大大增强，ABEI检出限为2xlO4rnol／L(S／N=31.IgG的检出限为lx10g／mE(S／N=3)。线性范围为3.0xl0-11-1XlO-gg／mL。在浓度为1．0xl0~g／mL时的RSD为3.1％。说明金微粒化学发光的催化放大作用在化学发光免疫分析方法中有很大的应用前景。