免疫浸润结合单细胞分析,7分文章等你来发!

大家好！今天给大家介绍一篇2021年10月发表在Cancer Immunology, Immunotherapy（IF:6.968）上的文章。作者对结肠癌患者的免疫细胞浸润水平进行全面分析，构建可以准确预测患者预后和免疫治疗反应的风险打分模型。

Identification and quantification of immune infiltration landscape on therapy and prognosis in left‐ and right‐sided colon cancer

鉴定和定量结肠癌的免疫浸润情况与预后和免疫治疗的关系

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1.数据集的获取和下载

从TCGA数据库和GEO数据库下载COAD数据集和GSE103479的转录组数据，体细胞突变数据和临床数据。

2.LCC和RCC的ICI情况

从TCGA数据集和GEO数据集共获得411例LCC样本和RCC样本。对这些样本进行ESTIMATE和CIBERSORT分析计算ICI情况。免疫细胞的相关性如图1A所示，不同类型的巨噬细胞与免疫打分高度正相关，一致性聚类分析鉴定到3个亚型（图1B）。三个ICI免疫亚型的预后分析表明ICI clusterA的预后较好（图1C和1D）。不同ICI亚型的免疫细胞浸润水平分析表明ICI clusterB中浆细胞，CD8+ T细胞，活化的记忆CD4+ T细胞，M1巨噬细胞，M2巨噬细胞，静息树突状细胞，地活化树突状细胞和活化肥大细胞浸润比例较高，且clusterB与预后较差有关（图1F）。预后较差的亚型中CD8+ T细胞高度浸润，ICI clusterB中PD-L1的表达水平较高（图1G）。

图1 ICI亚型的免疫细胞浸润水平分析

3.ICI亚型的DEGs

作者对三个ICI亚型进行差异分析共鉴定到1041个DEGs，对DEGs进行聚类分析共聚为三个clusters（图2A）。随后，作者对DEGs进行GO和KEGG分析（图2B和2C），DEGs的聚类热图如图2D所示。KM分析表明gene clusterC的预后较好（图2E），gene clusterC的B细胞，浆细胞，静息记忆CD4+ T细胞，活化DCs，活化肥大细胞和免疫打分较高，而活化记忆CD4+ T细胞，M0巨噬细胞，M1巨噬细胞，M2巨噬细胞和基质打分较低（图2F）。

图2 差异分析

4.构建ICI打分

作者使用PCA分析对差异基因进行降维，将特征基因的总打分定义为ICI打分，使用R包maxstat计算ICI打分阈值，将TCGA患者分为高ICI组和低ICI组（HSG和LSG）。KM分析表明LSG的预后较好，单因素和多因素Cox分析表明ICI打分是独立预后因子。Imvigor210数据集分析表明ICI打分可以准确预测患者预后情况（图5E）。GSEA分析表明细胞循环过程，DNA转运，复制和修复过程显著富集于HSG组（图3B和3C）。图3D为患者肿瘤部位，基因簇和ICI打分分布情况（图3D）。

图3 ICI打分

5.ICI打分预测治疗反应的作用

接下来作者分析不同亚组对免疫治疗敏感性的差异，结果表明LSG组的EGFR抑制剂，AKT抑制剂敏感性和IC50显著低于HSG组（图4A和4B），而HSG组的VEGFR2抑制剂，HH信号抑制剂，DNA合成抑制剂和JNK抑制剂敏感性显著低于LSG组（图4C-4F）。免疫检查点表达水平分析表明HSG组中PDCD1，PDCD1LG2，HAVCR2和LAG3的表达水平较高（图4G-4J），表明HSG患者受益于免疫治疗。

图4 免疫治疗抑制剂敏感性分析

作者使用两种方法验证ICI打分预测免疫治疗反应的能力。首先，作者分析HSG和LSG与IPS的关系，两组中IPS，IPS-PD1/PD-L1/PD-L2和IPS-CTLA4显著不同（图5A-5C）。在CR/PR组的ICI打分显著高于SD/PD组（图5F），HSG患者的CR/PR比例显著高于LSG患者（图5G）。总的来说，作者构建的ICI打分可以预测患者的免疫治疗受益情况。

图5 IPS和ICI打分的相关性

6.ICI打分和TMB的相关性

HSG组的TMB显著高于LSG组（图6A），ICI打分和TMB显著正相关，gene clusterC组的患者预后较好且主要分布于图6B的左下角。根据TMB将患者分为high-TMB和low-TMB组，high-TMB组的预后较差（图6C）。而TMB不会影响ICI打分对患者预后的预测作用（图6D）。总的来说，ICI打分可以作为LCC和RCC的预后指标，有效预测TMB和免疫治疗敏感性。此外，作者分析了HSG和LSG组的体细胞突变情况，突变频率最高的20个基因如图6E和6F所示。

图6 ICI打分和TMB相关性

7.基于ICI打分鉴定关键基因

为鉴定DEGs中的关键基因作者进行WGCNA分析，其中灰色模块与ICI打分高度相关，因此作者对灰色模块中的基因进行预后分析。其中基因CA2, CXCL1, DUOX2, DUOXA2, IER3, PLAC8, TSPAN1和SDH与预后较好有关。此外，作者在DisNor数据库中搜索这些基因的邻近调控因子，CXCL1的上游调控因子包括SMO,CEBPD,MTA1和FZD3，下游调控因子包括PLCE1,PRKACA,GLI1,GLI2和GLI3。HNRNPU和MAPK1是IER3的上游调控因子，PPP2R5C是下游调控因子。PPI调控网络分析表明这两个基因与其他6个基因存在复杂的相互作用。

图7 单细胞数据分析

随后，作者分析了这8个基因在免疫治疗队列中的表达水平。CA2,IER3和TSPAN1的表达水平在不同治疗结果组中具有显著差异（图8A-8C）。CA2（图8I-8M）和TSPAN1（图8N-8R）的表达水平在不同肿瘤组织和正常组织中具有显著差异。

图8 筛选到的关键基因的表达水平

总的来说，作者对LCC和RCC患者的ICI情况进行了全面的分析并构建风险打分模型可以准确评估患者的预后和评估免疫治疗敏感性。鉴定的ICI亚型有助于了解LCC和RCC患者的异质性。ICI打分和关键基因CA2及TSPAN1可以作为预测预后和免疫治疗反应的潜在标志物。本研究的局限性在于还需要实验验证本研究鉴定到的关键基因。

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